氯霉素是白色或無色的針狀或片狀結晶，熔點149.7~ 150.79C,易溶于甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，微溶于乙醚及氯仿，不溶于石油醚及苯。氯霉素極穩定，其水溶液經5h 煮沸也不失效。氯霉素分子中含有對位硝基苯基基團、丙二醇和二氯乙酰胺基。
由于氯霉素分子中有2 個不對稱碳原子，所以氣霉素有4 個光學異構體，其中只有左旋異構體具有抗菌能力。2017年10月27日，世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單初步整理參考，氯霉素在2A類致癌物清單中。
氯霉素類抗生素可作用于細菌核糖核蛋白體的50S亞基，而阻撓蛋白質的合成，屬抑菌性廣譜抗生素。
細菌細胞的70S核糖體是合成蛋白質的主要細胞成分，它包括50S和30S兩個亞基。氯霉素通過可逆地與50S亞基結合，阻斷轉肽酰酶的作用，干擾帶有氨基酸的胺基酰-tRNA終端與50S亞基結合，從而使新肽鏈的形成受阻，抑制蛋白質合成。
由于氯霉素還可與人體線粒體的70S結合，因而也可抑制人體線粒體的蛋白合成，對人體產生毒性。因為氯霉素對70S核糖體的結合是可逆的，故被認為是抑菌性抗生素，但在高藥物濃度時對某些細菌亦可產生殺菌作用，對流感桿菌甚至在較低濃度時即可產生殺菌作用。
氯霉素對革蘭陽性、陰性細菌均有抑制作用，且對后者的作用較強。其中對傷寒桿菌、流感桿菌、副流感桿菌和百日咳桿菌的作用比其他抗生素強，對立克次體感染如斑疹傷寒也有效，但對革蘭陽性球菌的作用不及青霉素和四環素。抗菌作用機制是與核蛋白體50S亞基結合，抑制肽酰基轉移酶，從而抑制蛋白質合成。
各種細菌都能對氯霉素發生耐藥性，其中以大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌等較為多見，傷寒桿菌及葡萄球菌較少見。
細菌對氯霉素產生耐藥性比較慢，可能是通過基因的逐步突變而產生的，但可自動消失。細菌也可以通過R因子的轉移而獲得耐藥性，獲得R因子的細菌能產生氯霉素乙酰轉移酶使氯霉素滅活。