TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細胞凋亡時，細胞內特異性核酸內切酶活化，染色質DNA在核小體間被特異性切割，DNA降解成180~200 bp或其它整數(shù)倍片段。本試劑盒采用TUNEL（TdTmediated dUTP Nick End Labeling）法，工作原理在于：DNA分子斷裂產(chǎn)生的3′-羥基（3′-OH）末端可以在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（TdT, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase）的催化下結合熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷（FITC-12-dUTP），F(xiàn)ITC-12- dUTP標記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量分析，從而反映細胞凋亡水平。

本試劑盒對標記反應進行了優(yōu)化，采用最佳比例的熒光素標記和未標記的dNTP進行3’-OH末端的核苷酸摻入，使得同一個斷裂的DNA片段末端可以形成更長的“標記尾巴"，該“標記尾巴"減少了相鄰摻入dNTP上標記基團的空間位阻，增加了每個斷裂片段末端的熒光基團數(shù)目，降低了熒光基團相鄰后可能造成的聚集和淬滅，從而提高檢測靈敏度，減少非特異性反應。

本試劑盒應用廣泛，適用于檢測冰凍切片、石蠟切片，貼壁細胞以及懸浮細胞的凋亡情況。

產(chǎn)品組成

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。注意：FITC-12-dUTP Labeling Mix（MX3216-B）需避光保存。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 極少數(shù)細胞凋亡不會發(fā)生DNA斷裂，此時不適用于TUNEL法檢測。另，少數(shù)類型的壞死細胞中也可能發(fā)現(xiàn)DNA斷裂，檢測出TUNEL陽性。如果實驗要求嚴格判定細胞凋亡，建議同時檢測多個凋亡指標，比如Annexin V早期凋亡檢測，Caspase凋亡蛋白活性檢測。

2） 熒光物質易發(fā)生淬滅，試劑儲存和操作過程中盡量避光。熒光檢測時也盡量縮短觀察時間。

3） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法（TUNEL染色）

一、 石蠟包埋組織切片的實驗流程

1.1樣本預處理（石蠟包埋組織切片）

1.1.1 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5~10min，重復一次，以徹di脫掉石蠟。

1.1.2 室溫下用無水乙醇浸泡切片5min，重復一次。

1.1.3室溫下用梯度乙醇（90%、80%、70%）各浸泡潤洗1次，每次3min。

1.1.4用PBS浸泡潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

1.1.5 按照1:100的比例，用PBS稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。每個樣本上滴加100μl稀釋好的Proteinase K溶液（20μg/ml），使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20min。

1.1.6用PBS浸泡潤洗樣本3次，每次5min，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

1.2【可選步驟】陽性對照-DNase I處理

【注意：僅陽性對照進行此步驟，其他樣本直接進入步驟1.3標記及檢測】

1.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀釋10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer備用。

1.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5min。

1.2.3用1× DNase I Buffer稀釋DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其終濃度為20 U/ml。

1.2.4輕輕洗掉樣本上的多余液體，滴加100μl 稀釋好的DNase I（20 U/ml）工作液，室溫孵育10min。

1.2.5輕輕洗掉多余液體，并且將切片放入裝有PBS的染色缸中徹di浸泡潤洗2~3次。

1.3標記及檢測

1.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

1.3.2每個樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆蓋全部待檢區(qū)域，室溫平衡10~30min。

1.3.3平衡期間于避光條件下按照下表配制標記反應液。

1.3.4平衡結束后，用吸水紙吸掉1×Equilibration Buffer，然后在樣本上滴加50μl 新鮮配制的標記反應液，注意避光。

1.3.5在避光的黑色濕盒底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內，37℃孵育60min。

1.3.6輕輕去掉多余液體，用新鮮的PBS清洗2次，每次室溫孵育5min。

1.3.7用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

1.3.8用新鮮配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中對樣本進行復染，室溫避光孵育5min。

1.3.9洗滌樣本，將載玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

1.3.10輕輕洗掉多余液體，并且向樣本區(qū)域滴加適量抗熒光淬滅劑，進行封片。

1.3.11立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光，或在460nm處觀察DAPI的藍色熒光。

二、 冰凍組織切片的實驗流程

2.1樣本預處理（冰凍組織切片）

2.1.1 將冰凍切片置于片架上，室溫晾干20min。

2.1.2 將玻片浸沒在4%多聚甲quan溶液（溶于PBS）（比如：MM1504-100ML）中固定，室溫固定30min。

2.1.3輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

2.1.4將玻片浸沒在PBS溶液中清洗兩次，每次5min。

2.1.5輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

2.1.6用PBS制備0.2% Triton X-100。每個樣本上滴加100μl 0.2% Triton X-100，使其覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育15min。如果通透效果不好，則：按照1:100的比例，用PBS稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。每個樣本上滴加100μl稀釋好的Proteinase K溶液（20μg/ml），使其覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育10min。

2.1.7用PBS溶液潤洗樣本2-3次，每次5min，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持濕潤。

2.2 【可選步驟】陽性對照-DNase I處理

【注意：僅陽性對照進行此步驟，其他樣本直接進入步驟2.3標記及檢測】

2.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀釋10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer備用。

2.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5min。

2.2.3用1× DNase I Buffer稀釋DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其終濃度為20 U/ml。

2.2.4輕輕洗掉樣本上的多余液體，滴加100μl 稀釋好的DNase I（20 U/ml）工作液，室溫孵育10min。

2.2.5輕輕洗掉多余液體，并且將切片放入裝有PBS的染色缸中徹di浸泡潤洗2~3次。

2.3標記及檢測

2.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

2.3.2每個樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆蓋全部待檢區(qū)域，室溫平衡10~30min。

2.3.3平衡期間于避光條件下按照下表配制標記反應液。

2.3.4平衡結束后，用吸水紙吸掉1×Equilibration Buffer，然后在樣本上滴加50μl 新鮮配制的標記反應液，注意避光。

2.3.5在避光的黑色濕盒底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內，37℃孵育60min。

2.3.6輕輕去掉多余液體，用新鮮的PBS清洗2次，每次室溫孵育5min。

2.3.7用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

2.3.8用新鮮配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中對樣本進行復染，室溫避光孵育5min。

2.3.9洗滌樣本，將載玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

2.3.10輕輕洗掉多余液體，并且向樣本區(qū)域滴加適量抗熒光淬滅劑，進行封片。

2.3.11立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光，或在460nm處觀察DAPI的藍色熒光。

三、 貼壁細胞的實驗流程

3.1樣本預處理（貼壁細胞）

3.1.1實驗前準備

◇ 細胞爬片的準備

在Lab-Tek載玻片小室或TC處理的細胞爬片上培養(yǎng)貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后，用PBS清洗載玻片2次，進入后續(xù)實驗。

◇ 細胞涂片的制備

以2×106 cells/ml的濃度將細胞重懸于PBS中。吸取50~100 μl 細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上。用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液，進入后續(xù)實驗。

3.1.2 將爬片或涂片浸入裝有4%多聚甲醛（溶于PBS）（比如：MM1504-100ML）的染色缸中，4℃放置25min，以固定細胞。

3.1.3 將爬片或涂片浸入PBS中清洗2次，每次室溫放置5min。

3.1.4 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干爬片或涂片上樣本周圍多余的液體。

3.1.5 將爬片或涂片浸入0.2% Triton X-100（in PBS），室溫孵育5min進行通透處理。

3.1.6用PBS潤洗樣本2-3次，每次3-5min，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存濕潤。

3.2【可選步驟】陽性對照-DNase I處理

【注意：僅陽性對照進行此步驟，其他樣本直接進入步驟3.3標記及檢測】

3.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀釋10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer備用。

3.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5min。

3.2.3用1× DNase I Buffer稀釋DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其終濃度為20 U/ml。

3.2.4輕輕洗掉樣本上的多余液體，滴加100μl 稀釋好的DNase I（20 U/ml）工作液，室溫孵育10min。

3.2.5輕輕洗掉多余液體，并且將爬片或涂片放入裝有PBS的染色缸中徹di浸泡潤洗2~3次。

3.3標記及檢測

3.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

3.3.2每個樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆蓋全部待檢區(qū)域，室溫平衡10~30min。

3.3.3平衡期間于避光條件下按照下表配制標記反應液。

3.3.4平衡結束后，用吸水紙吸掉1×Equilibration Buffer，然后在樣本上滴加50μl 新鮮配制的標記反應液，注意避光。

3.3.5在避光的黑色濕盒底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內，37℃孵育60min。

3.3.6輕輕去掉多余液體，用新鮮的PBS清洗2次，每次室溫孵育5min。

3.3.7用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

3.3.8用新鮮配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中對樣本進行復染，室溫避光孵育5min。

3.3.9洗滌樣本，將載玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

3.3.10輕輕洗掉多余液體，并且向樣本區(qū)域滴加適量抗熒光淬滅劑，進行封片。

3.3.11立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光，或在460nm處觀察DAPI的藍色熒光。

四、 懸浮細胞的實驗流程

4.1將（3~5）×106個細胞用PBS清洗2次，每次于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，然后，用0.5mlPBS重懸。

4.2加入5ml 1%多聚甲醛（in PBS），4℃孵育20min進行細胞固定。

4.3于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用5ml PBS重懸細胞。

4.4重復離心并用0.5ml PBS重懸細胞。

4.5加入5ml 0.2% Triton X-100（in PBS），室溫通透5min；或加入5ml冰上預冷的70%乙醇，在-20℃孵育4h。

4.6于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用5ml PBS重懸細胞。重復離心并用1ml PBS重懸細胞。

4.7轉移2×106個細胞到新的1.5ml離心管。

4.8于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，并且用100μl 1×Equilibration Buffer【于使用前，按1:5的比例用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer】重懸細胞。室溫孵育5min。

4.9平衡期間于避光條件下按照下表配制標記反應液。冰上融化FITC-12-dUTP Labeling Mix。

4.10于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用50μl 新鮮配制的標記反應液重懸細胞。37℃避光孵育60min，每隔15min輕彈管壁或用微量移液器輕輕重懸細胞。

4.11加入1ml 20mM EDTA終止反應，用移液器輕柔混勻。

4.12于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用1ml 0.1% Triton X-100（in PBS）+5mg/ml BSA重懸細胞，重復1次，共洗2次。

4.13于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用0.5ml新鮮配制的PI溶液（5μg/ml in PBS）重懸細胞，其中含250μg RNase A（DNase-free）。

4.14在黑暗中室溫孵育細胞30min。

4.15用流式細胞儀分析細胞。或用標準的熒光濾片裝置來分析細胞。在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光。

使用方法（TUNEL和免疫熒光共染）

一、 石蠟組織切片的共染步驟

二、 冰凍組織切片的共染步驟

三、 細胞爬片的共染步驟

常見問題

1. 陽性細胞數(shù)量少

通透不充分，可通過調整蛋白酶K或Triton X-100的孵育時間優(yōu)化通透步驟。

2. 高背景（如未凋亡細胞的強綠色熒光背景）

非特異性摻入FITC-12-dUTP。處理方法：在操作過程中保持細胞潤濕；標記反應完成，載玻片在用PBS洗一次后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5min。

3. 組織切片從載玻片上脫落

組織切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷（TESPA）包被顯微鏡載玻片，比多聚賴氨酸（PLL）的效果更好。

4. 顯微鏡或流式細胞儀分析只剩下很少的細胞

在操作過程中丟失大量細胞，處理方法：1）可以提高起始的細胞量；2）在制備細胞懸液時，離心過程中用含1% BSA的PBS清洗細胞。

5. 標記率低

如果以乙醇或甲醇固定的樣本，則標記效率較低。原因是：固定時染色質未能與蛋白質交聯(lián)，而在操作中丟失。應該用4%多聚甲醛（in PBS）或福爾馬林或戊二醛固定。

過度的固定導致與蛋白質過度交聯(lián)，也會導致標記效率低。可以適當縮短固定時間。或用2%多聚甲醛（in PBS）固定。

6. 假陽性

某些肌組織的冰凍切片，如果制片過程中沒有經(jīng)過多聚甲醛固定，容易出現(xiàn)內源性核酸酶切割DNA導致假陽性，應該將組織取出后及時用多聚甲醛固定，另外，盡量避免用蛋白酶K通透。

蛋白酶K工作液處理時間、溫度需摸索最適條件，溫度過高，時間過長，容易破壞核酸結構，出現(xiàn)假陽性。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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